離子交換色譜法(HPLC、LPLC):基于電荷差異進(jìn)行分析。葡萄糖與血紅蛋白(Hb)的β鏈N末端纈氨酸(Val)結合降低了等電點(diǎn),導致糖化Hb帶的正電荷比未糖化Hb的少,與樹(shù)脂的附著(zhù)力小,可以分別用不同的離子濃度的緩沖液在不同的時(shí)間將Hb從陽(yáng)離子交換柱中洗脫下來(lái),再根據每個(gè)峰值下的面積來(lái)計算HbA1c占總Hb的比例。
精密度高,有些產(chǎn)品CV可以小于1%
非特異性問(wèn)題存在,有些產(chǎn)品仍會(huì )受變異Hb 、氨基甲?;鸵阴;疕b影響
可采用高通量的高效液相色譜(HPLC)和低壓系統(LPLC)方法
美國糖化血紅蛋白標準化計劃(NGSP)的參考方法
電泳法(Elec):研制于上世紀80年代,與離子交換層析法一樣也是基于糖化和非糖化Hb所帶的電荷不同進(jìn)行分離。該方法操作簡(jiǎn)易,不受溫度、pH影響,在當時(shí)相對其他方法來(lái)說(shuō)精密度較高,但是需成批樣本分析,分析時(shí)間較長(cháng),臨床上現已較少使用。
親和色譜法(HPLC-af chr):基于結構不同進(jìn)行分析。利用對m-氨苯基硼酸依賴(lài)的糖化血紅蛋白1,2-順式二醇基團和固定的硼酸陰離子的特殊反應而設計的。與Hbα和β鏈的纈氨酸(Val)和賴(lài)氨酸(?-Lys)連接的葡萄糖均會(huì )與硼酸結合形成可逆的復合物,未糖化Hb先被洗脫后,再用山梨醇分離復合物,并將全部糖化Hb洗脫出來(lái)。
檢測結果是“總”糖化Hb,通過(guò)校準其結果與HPLC有良好的相關(guān)性
不受溫度、尿毒癥、HbF或Schiff base的干擾
室內精密度較高,實(shí)驗室間的結果存在差異
免疫法(Im tur):抗原抗體反應原理。單克隆抗體技術(shù)的運用使該方法有了快速發(fā)展,最早是英國Dako公司研制出識別葡萄糖附著(zhù)在Hb的β鏈N末端8個(gè)氨基酸抗原位點(diǎn)的單克隆抗體,用酶免疫原理(EIA)進(jìn)行檢測。
具有較好的精密度、與其他方法有較好的相關(guān)性
可以在自動(dòng)生化儀上用比濁法進(jìn)行定量測定
抗原與IFCC一級參考物質(zhì)β鏈N末端6個(gè)氨基酸肽端相似
如果用6個(gè)氨基酸的為抗原,當Hb發(fā)生第6位氨基酸變異[HbS(β6glu→val)和HbC(β6glu→lys)]時(shí)將不會(huì )被識別,可導致廠(chǎng)家間的檢測結果存在著(zhù)偏倚
各廠(chǎng)家產(chǎn)品的單抗針對的抗原決定簇不同、親和力不同等因素也會(huì )影響結果的可比性
酶法(En):近幾年才推出在自動(dòng)生化儀上測定的生化反應方法。其原理是在蛋白酶的作用下,切斷HbA1c的?鏈N末端的糖化二肽,糖化二肽在果糖基肽氧化酶的作用下生成過(guò)氧化氫,在過(guò)氧化物酶的存在下與顯色劑產(chǎn)生顯色反應,通過(guò)測定吸光度求出HbA1c的百分濃度。該方法精密度好,同HPLC和免疫法均有較好的相關(guān)性。
快速檢驗(POCT:Mic chr、Flu im)